血液由血酱和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的组成中，除水分以外，约90是血红蛋白。血红蛋白由四条肽链组成（图5—17），包括两条q—肽链和两条b—肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基因，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈现红色。本课题可以选用猪，牛，羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。
红细胞的洗涤。洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500r？/in，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血酱，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水（质量分数为0。9的nac1溶液），缓缓搅拌10min，低速短时间离心。如此重复洗涤三次，直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。
血红蛋白的释放，将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min后，可以明显看到试管中的溶液分为4层（图5—18）。从上往下数，第一层为无色透明的甲苯层，第二层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第三层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液。第四层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透液体。
透折，取1ml的血红蛋白溶液装入透折袋中，将透折袋放入盛有300ol的磷酸缓冲液中（ph为7。0），透折12h。
接着讲：凝胶色谱操作，可以自已制作色谱柱，有条件的学校也可以直接购买商品色谱柱。凝胶色谱柱的制作，取长40c的玻璃管，两端磨平，柱底部的制作方法如下（图5—9）。首先选择适合封堵玻璃管口的橡皮塞，中间打孔，孔径大小要能够紧密插入0。5ml的移液管。将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴，将0。5长的一段，插入橡皮塞孔内，插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面。将尼龙网剪成与橡皮塞上部一样大小的圆片，覆盖在橡皮塞的凹穴上，再用大小合适的100目的尼龙纱将橡皮塞上部包好，插到玻璃管的一端。在色谱柱下端用移液管头部作出口部位，连接一细的尼龙管，并用螺旋夹控制尼龙管的打开与关闭，尼龙管的另一端放入收集色谱流出液的收集器内。柱顶部的制作只需在色谱柱的另一端插入安装了玻璃管的橡皮塞即可。
凝胶色谱柱的装填，装柱前要将色谱柱垂直固定在支架上。因为干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积差别很大，因此装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。本实验使用的是交联葡聚糖凝胶（”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7。5g。凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙管打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。注意色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。装填后，立即连接缓冲液脱瓶，在约50cl的物质的浓度为20ol？/lrdoq磷酸缓冲液（ph为7。0）充分冼涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。
样品的加入和冼脱，加样前，打开色谱桩下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢降到与凝胶面平齐，关闭出口。用吸管小心地将1ml透折后的样品加到色谱柱的顶端（图5—22），注意不要破坏凝胶面。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入物质的量浓度为20o1/lr的磷酸缓冲液（ph为7。0）到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行冼脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一管，连续收集（5—21）。
判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的签定。在签定的方法中，使用最多的是sds—聚丙烯酰凝胶电泳。有条件的学校，可以参考生物化学实验的有关书籍，尝试sds—聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作。下图是聚丙烯酰胺凝胶电泳的装置及其原理示意图（图5—23）。
红细胞的冼涤，洗涤次数，离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白，离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。有兴趣的同学可以尝试不同的洗涤次数，离心速度和时间，探索最佳处理条件。
色谱柱填料的处理，商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需直接放在洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾。通常只需1—2h。这种方法不但世约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。
凝胶色谱柱的装填，在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会脱搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。在凝胶色谱操作过程中，不能发生冼脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生这种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。
蛋白质的分离，在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程
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